Nanoerwärmung und Eis

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 220 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine erfolgreiche Langzeitkonservierung von Organen oder Gewebe würde die Biomedizin revolutionieren. Die Kryokonservierung von Knorpel ermöglicht eine längere Haltbarkeit des Gelenkknorpels und bietet die Möglichkeit, die Umsetzung vielversprechender osteochondraler Allotransplantate (OCA) zur Knorpelreparatur auszuweiten. Allerdings kann kryokonservierter großformatiger Knorpel aufgrund seiner begrenzten Erwärmungsrate mit dem herkömmlichen Ansatz der Konvektionserwärmung nicht erfolgreich erwärmt werden, was sein klinisches Potenzial blockiert. Hier entwickeln wir eine nanoerwärmende und eisfreie Kryokonservierungsmethode zur Erhaltung großformatiger, intakter Gelenkknorpel. Unsere Methode erreicht eine Erwärmungsrate von 76,8 °C min-1, mehr als eine Größenordnung höher als die Konvektionserwärmung (4,8 °C min-1). Mithilfe systematischer Tests auf Zell- und Gewebeebene zeigen wir die überlegene Leistung unserer Methode bei der Erhaltung großer Knorpel. Eine tiefenabhängige Konservierungsweise wird auch durch Magnetresonanztomographie und Computermodellierung beobachtet und rekapituliert. Abschließend zeigen wir, dass die Abgabe von Nanopartikeln an die OCA-Knochenseite eine mögliche Richtung für die weitere Optimierung unserer Methode sein könnte. Diese Studie leistet Pionierarbeit bei der Anwendung von Nanoerwärmung und eisfreier Kryokonservierung für großen Gelenkknorpel und liefert wertvolle Erkenntnisse für die zukünftige Technikentwicklung und ebnet den Weg für klinische Anwendungen von kryokonserviertem Knorpel.

Die Organ- oder Gewebetransplantation hat Millionen von Leben gerettet und die Lebensqualität von Patienten verbessert, die an Organversagen oder Gewebeerkrankungen leiden1,2. Allerdings reicht die Zahl der für eine Transplantation bereitstehenden Organe und Gewebe bei weitem nicht aus, um den Bedarf der Patientenpopulation zu decken. Beispielsweise wurden im Jahr 2020 in den Vereinigten Staaten 39.036 Organtransplantationen durchgeführt und gleichzeitig 55.121 neue Kandidaten auf die Warteliste gesetzt3; Viele Patienten sterben, während sie auf eine Organtransplantation warten. Trotz des enormen ungedeckten Bedarfs an Organen und Geweben ist die enttäuschende Tatsache, dass viele Organe und Gewebe nicht für die Implantation geeignet sind und verworfen werden, weil sie die maximale postmortale Aufbewahrungszeit erreichen1,4. Bei einer Organtransplantation verfallen bis zu 70 % der Spenderorgane, bevor sie den Patienten erreichen1,4. Der langfristige Erhalt von Organen und Gewebe ist entscheidend für die Verbesserung der Auslastung und die Linderung bestehender Engpässe.

Gelenkknorpeldefekte sind häufige Knieprobleme und betreffen 60–66 % der Patienten, die sich arthroskopischen Eingriffen unterziehen5,6,7,8. Aufgrund der begrenzten Regenerationsfähigkeit des Gelenkknorpels können sich Knorpeldefekte ohne ordnungsgemäßen chirurgischen Eingriff zu Arthrose (OA) entwickeln. Arthrose betrifft mehr als 25,6 Millionen Erwachsene und verursacht in den Vereinigten Staaten jedes Jahr Kosten in Höhe von fast 200 Milliarden US-Dollar9. Da die Bevölkerung wächst und altert, wird die Zahl der OA-Patienten voraussichtlich dramatisch ansteigen10. Derzeit gibt es keine Heilung für Arthrose, was die Notwendigkeit weiterer Forschung auf diesem Gebiet verdeutlicht. Die Transplantation osteochondraler Allotransplantate (OCA) ist eine attraktive Knorpelreparaturstrategie zur Bewältigung des Fortschreitens der Arthrose, insbesondere für junge und körperlich aktive Patienten mit großen Defekten11. Im Vergleich zu anderen Behandlungsoptionen wie Mikrofrakturierung, autologer Chondrozytenimplantation, osteochondraler Autotransplantattransplantation und neuen Ansätzen zur Gewebezüchtung ersetzt die OCA-Transplantation die Defektstelle sofort durch funktionsfähigen hyaliner Knorpel voller Dicke, erfordert nur einen einzigen chirurgischen Eingriff und vermeidet das Problem Sterblichkeit an der Entnahmestelle12,13. Die OCA-Transplantation ist auch eine bevorzugte chirurgische Wahl für Patienten mit ausgedehnten Knorpelschäden, subchondralen Knochenverletzungen oder fehlgeschlagenen vorherigen Knorpeloperationen12,13. Die mittlere 10-Jahres-Überlebensrate nach einer OCA-Transplantation beträgt 78,7 %14, und 75–88 % der Patienten können nach der Transplantation wieder Sport treiben15. Der klinische Einsatz der OCA-Transplantation zur Knorpelwiederherstellung hat im letzten Jahrzehnt an Popularität zugenommen16, und es wird erwartet, dass in Zukunft ein größerer Bedarf an OCAs besteht. Allerdings ist die Verfügbarkeit frischer OCAs begrenzt. Aktuelle Goldstandard-Hypothermielagerungsmethoden für die OCA-Lagerung können die funktionellen Eigenschaften von OCA nur bis zu 28 Tage vor der Implantation bewahren17,18. Dieser Zeitrahmen reicht oft nicht aus, wenn man bedenkt, wie viel Zeit für die Operationsplanung benötigt wird, einschließlich der OCA-Entnahme, des Transports, eines mindestens 14-tägigen Screenings auf Infektionskrankheiten, des Transplantatabgleichs, der Patientenvorbereitung und anderer damit verbundener Logistik. Fast 30 % der OCAs werden in den Vereinigten Staaten ohne Implantation verworfen19, was die Verfügbarkeit von OCAs noch weiter erschwert und die breite Umsetzung der OCA-Transplantation einschränkt.

Um die Haltbarkeit von OCAs zu verbessern, wurden Langzeitkonservierungsmethoden eingesetzt. Frühe Versuche schlugen die Verwendung einer einfachen Gefriermethode zur OCA-Konservierung vor, spätere Studien zeigten jedoch, dass der mit dieser Methode konservierte Knorpel eine geringe Lebensfähigkeit der Zellen und eine schlechte extrazelluläre Integrität aufweist, was zu beeinträchtigten Ergebnissen bei Transplantationsstudien an Tieren und Menschen führte20,21. Anschließend wurde die Vitrifikation eingeführt, ein Prozess, der eine flüssige Lösung ohne Eisbildung in einen glasigen Feststoff überführt. Bei diesem Ansatz werden OCAs in hochkonzentrierte Kryoschutzmittellösungen (CPA) getaucht und dann auf tiefe Minustemperaturen abgekühlt. Durch den Einbau von CPAs werden die Anforderungen an die Kühlgeschwindigkeit erheblich reduziert, sodass eine eisfreie Lagerung mit routinemäßiger Laborausrüstung möglich ist. Die Vitrifikation wurde erfolgreich zur Kryokonservierung von OCAs in kleinen Mengen bei mehreren Arten eingesetzt, darunter Kaninchen22,23, Schweine24,25 und Menschen26,27. In diesen Studien war die Größe der Gelenkknorpelproben auf einen Durchmesser von 10 mm begrenzt und das Volumen der umgebenden CPA-Lösung wurde unter 3 ml gehalten. Da 36–54 % der Knorpeldefekte größer als 1 cm2 sind 5,7, ist die Kryokonservierung großer OCAs erforderlich, bleibt jedoch eine Herausforderung, insbesondere im Hinblick auf den Erwärmungsprozess28,29. Derzeit werden vitrifizierte Proben üblicherweise durch eine Konvektionsstrategie unter Verwendung eines warmen Wasserbads (37 °C) erwärmt. Die Wärme wird allmählich vom Wasserbad über die umgebende CPA und schließlich in das Gewebe übertragen. Aufgrund der Wärmeübertragungsgrenze kann es jedoch sein, dass die Konvektionserwärmung bei größeren Proben die CPA-kritischen Erwärmungsraten (normalerweise um mehrere Größenordnungen höher als die kritischen Abkühlungsraten) nicht erreicht, was zu einer schädlichen Eisbildung führt. Darüber hinaus könnte eine ungleichmäßige Erwärmung während der Konvektionserwärmung zu einer thermischen Belastung führen, die über die mechanische Nachgiebigkeit der Probe hinausgeht, was zu Rissen und Schäden an den konservierten Proben führen30,31,32.

Zur Lösung der Probleme mit der Erwärmungsrate und der Gleichmäßigkeit wurden mehrere volumetrische Erwärmungsmethoden vorgeschlagen, darunter Lasererwärmung und Mikrowellenerwärmung. Die Lasererwärmungsmethode erhitzt die Probe in Gegenwart von laserabsorbierenden Molekülen, wie z. B. Gold-Nanostäben, schnell33,34. Trotz seiner ultraschnellen Erwärmungseffizienz ist seine Anwendung aufgrund der Einschränkung der Lasereindringtiefe derzeit auf die Erwärmung von Mikroliterproben wie Zellen und Embryonen beschränkt33,34. Die Mikrowellenerwärmung kann die Probe direkt erwärmen, indem die elektrischen Dipole ihrer Moleküle mit hochfrequenten (Hunderte MHz bis GHz) elektromagnetischen Feldern angeregt werden35,36. Obwohl mit dieser Methode eine hohe Erwärmungsrate erreicht werden kann, ist sie anfällig für thermisches Durchgehen, ein Phänomen erhöhter Temperaturunterschiede zwischen der erwärmten Stelle und der kalten Stelle aufgrund der temperaturabhängigen dielektrischen Eigenschaft der erhitzten Probe, was zu ungünstigen Hot Spots führt28,35 ,36. Die Heizeffizienz oder das Profil der Mikrowellenerwärmung hängt auch von der Probenform ab35,37, was ihre allgemeinen Anwendungen weiter erschwert.

Kürzlich wurde eine Nanoerwärmungstechnik für die Kryokonservierung großer Proben entwickelt28,30,31,32,38,39,40,41. Verglaste Proben, die mit magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (mIONPs) beladen sind, werden zur Erwärmung einem niedrigen hochfrequenten alternativen Magnetfeld (Hunderte von kHz) ausgesetzt, im Gegensatz zur herkömmlichen Konvektionserwärmung, die auf einer passiven Wärmeübertragung vom Wasserbad auf die Proben beruht. Im Gegensatz zur Hochfrequenz-Mikrowellen-Erwärmungsmethode37,42 kann das niederfrequente Magnetfeld selbst das Gewebe nicht schnell erwärmen; Es kann jedoch effizient Wärme durch die mIONPs induzieren, wobei die Stärke und Frequenz des Magnetfelds sowie die Konzentration der mIONPs abgestimmt werden können, um die gewünschte Heizrate zu erreichen30. Da das niederfrequente Magnetfeld das Gewebe ohne Abschwächung durchdringen kann, kann eine gleichmäßige Erwärmung erreicht werden, sobald das Magnetfeld homogen ist und die mIONPs gleichmäßig im Gewebe verteilt sind. Nanoerwärmung in Kombination mit Vitrifikation wurde mit unterschiedlichem Erfolg zur Konservierung von Schweinearterien30, Schweineherzklappen30, Rattennieren32 und Rattenherzen31,38 eingesetzt. Die Nanoerwärmung zur Erhaltung von Organen oder Gewebe steckt noch in den Kinderschuhen und der bisherige Fokus war auf dünne oder stark vaskularisierte biologische Systeme beschränkt. Dünne Gewebe wie Herzklappensegel und Arterien ermöglichen eine schnelle Wärmeübertragung mit Nanopartikeln in unmittelbarer Nähe, während vaskularisierte Systeme (z. B. Rattenherzen und Rattennieren) die Verteilung von Nanopartikeln im gesamten Organ erleichtern. Darüber hinaus ist es bemerkenswert, dass das tatsächliche Volumen der durch Nanoerwärmung erwärmten Organe gering ist; Das Volumen des Rattenherzens und der Rattenniere liegt beispielsweise beide unter 1 ml31,32,38. Es wurden keine Versuche unternommen, die Nanoerwärmungstechnik zur Erhaltung großer, dichter und avaskulärer Knorpelgewebe anzuwenden.

Hier haben wir eine Methode zur Nanoerwärmung und eisfreien Kryokonservierung entwickelt, indem wir Knorpelvitrifizierungs- und Nanoerwärmungstechniken zur Konservierung großer OCAs integriert haben. Mit dieser Methode wurde die Aufheizgeschwindigkeit während des Erwärmungsprozesses um eine Größenordnung verbessert, wodurch die Schwierigkeit einer langsamen Wiedererwärmung durch Konvektion in einem warmen Bad überwunden wurde. Außerdem wurde eine systematische Charakterisierung des Verhaltens auf Knorpelzell- und Gewebeebene durchgeführt, um eine umfassende Bewertung unserer Methode zur Konservierung großer OCAs zu ermöglichen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Nanoerwärmung und eisfreie Kryokonservierung die traditionelle Konvektionsmethode in Kombination mit eisfreier Kryokonservierung übertrafen, indem sie mehr lebende Zellen retteten und ein höheres Maß an Zellstoffwechselaktivität aufrechterhielten. Im Vergleich zur Konvektionserwärmung zeigte unsere Methode auch einen Trend zu einer besseren Leistung bei der Erhaltung des Knorpelmaterials und der mechanischen Eigenschaften. Zusammen mit Computermodellierung und Magnetresonanztomographie (MRT) wurde die experimentelle Beobachtung der tiefenabhängigen Konservierungsweise rekapituliert und die Abgabe von mIONPs an den subchondralen Knochen als mögliches Mittel zur weiteren Optimierung der Leistung unserer Methode für große OCA angedeutet Erhaltung. Diese Studie leistet Pionierarbeit bei der Anwendung der eisfreien Vitrifikation und Nanoerwärmung zur Erhaltung großer Gelenkknorpel und liefert wertvolle Erkenntnisse für die zukünftige Technikentwicklung und die Umsetzung dieser Technik in die klinische Praxis der OCA-Transplantation.

Große OCA-Proben (Länge × Breite × Dicke, ~30 mm × 20 mm × 14 mm) wurden geerntet (Abb. 1a) und nach einem schrittweisen Protokoll mit CPA-Lösungen bei 4 °C beladen, um die Vitrifizierung während des Abkühlprozesses sicherzustellen (Abb. 1b). Eine erfolgreiche OCA-Verglasung wurde erreicht, ohne dass in der Probe Risse oder Eisbildung beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 1a). Die Abkühlgeschwindigkeit erfüllte auch die Verglasungsanforderungen (Ergänzende Abbildung 1b, c). In der Nanoerwärmungsgruppe wurden mIONPs direkt nach dem letzten Schritt der CPA-Beladung hinzugefügt. In dieser Studie wurden mehrere CPA-Lösungen getestet, darunter VS55, VS70 und VS83. Nach der Vitrifizierung und Lagerung wurde die vitrifizierte OCA dann durch einen von zwei Mechanismen erwärmt: Konvektionserwärmung oder Nanoerwärmung. Die Konvektionserwärmung wurde erreicht, indem die Probe in ein 37 °C warmes Wasserbad gelegt wurde, während die Nanoerwärmung in einer maßgeschneiderten Spule mit einem hochfrequenten magnetischen Wechselfeld implementiert wurde (Abb. 1b). Temperaturmessungen in reinen CPA-Lösungen mit 2 mg ml−1 mIONPs zeigten, dass die Heizrate für die Nanoerwärmungsmethode 76,80 ± 2,27 °C min−1 betrug, was mehr als eine Größenordnung höher war als die erreichten 4,80 ± 1,51 °C min−1 durch Konvektionserwärmung (Abb. 1c und ergänzende Abb. 2). Während des Wiedererwärmungsprozesses wurden in der Nanoerwärmungsgruppe keine Risse beobachtet, während in der Konvektionsgruppe im umgebenden CPA deutlich Risse zu erkennen waren. Diese Ergebnisse zeigen in Übereinstimmung mit früherer Literatur28,30,31,32,38,39,40,41 die Fähigkeit zur schnellen Wiedererwärmung von Proben mithilfe von Nanoerwärmung. Daher ermöglicht unsere Methode die langfristige Konservierung großer OCAs.

a Schweine-Oberschenkel-Trochlea-OCA, das in dieser Studie verwendet wurde. Die OCA-Größe beträgt ~30 mm × 20 mm × 14 mm (Länge × Breite × Dicke). b Schematischer Ablauf zweier Kryokonservierungsmethoden. Bei beiden Strategien wurde die Schweine-OCA zunächst nach einem schrittweisen CPA-Beladungsprotokoll mit CPA-Lösung bei 4 °C beladen. Der OCA wurde in jedem Schritt 20 Minuten lang nacheinander in CPA-Lösung mit zunehmender Konzentration (0 %, 18,5 %, 25 %, 50 %, 75 % und 100 %) eingetaucht. Anschließend wurde der OCA verglast und in einem mechanischen Gefrierschrank gelagert. mIONPs wurden unmittelbar nach dem letzten Schritt der 100 %igen CPA-Beladung in einer Konzentration von 2 mg ml−1 für die Nanoerwärmungsgruppe hinzugefügt. Während der Wiedererwärmung wurde die Nanoerwärmung der verglasten OCAs in einer maßgeschneiderten Spule durchgeführt, die ein hochfrequentes alternatives Magnetfeld erzeugte, während die Konvektionserwärmung mit den verglasten OCAs in einem warmen Wasserbad (37 °C) durchgeführt wurde. Nach dem Wiederaufwärmen durchliefen alle OCAs einen Entladeschritt in umgekehrter Reihenfolge wie beim Ladeprotokoll, um die CPA zu entfernen. c Erwärmungsrate, die durch Konvektionserwärmung und Nanoerwärmung erreicht wird (ergänzende Abbildung 2d, e). n = 3 unabhängige Proben für die Konvektionsgruppe und n = 4 unabhängige Proben für die Nanoerwärmungsgruppe. Der p-Wert wurde mit einem zweiseitigen t-Test bestimmt. Alle Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung.

Ein alamarBlue-Assay wurde angewendet, um die Stoffwechselaktivität der Knorpelzellen nach dem Wiedererwärmen zu bewerten. In Übereinstimmung mit unserer vorherigen Studie25 zeigte der mit VS83 konservierte Knorpel sowohl in der Konvektions- als auch in der Nanoerwärmungsgruppe eine viel höhere Stoffwechselaktivität als der mit VS70 konservierte Knorpel (Abb. 2a). Die Ergebnisse mit dem am häufigsten verwendeten VS55 zeigten die niedrigste Zellstoffwechselaktivität (ergänzende Abbildung 3). Daher wurde VS83 für alle nachfolgenden Studien verwendet. Darüber hinaus hatte der Knorpel in der Nanoerwärmungsgruppe eine deutlich höhere Zellstoffwechselaktivität als durch Konvektion erwärmter Knorpel (Abb. 2a). Insbesondere mit VS83 nanoerwärmter Knorpel zeigte nach zweitägiger Kultur in Medien eine vollständige Wiederherstellung der Zellstoffwechselaktivität (Abb. 2a). Diese Ergebnisse deuten zusammen mit den Messungen der Kühl- und Heizrate (ergänzende Abbildungen 1, 2) auf eine bessere Erhaltung der Zellfunktion bei Nanoerwärmung im Vergleich zur Konvektionserwärmung hin. Die Lebensfähigkeit der Knorpelzellen wurde mittels Fluoreszenz-Lebend-/Totfärbung unmittelbar nach dem Wiedererwärmen untersucht. In der gesamten Probe waren frische Knorpelzellen am Leben und zeigten starke grüne Fluoreszenzsignale (Abb. 2b). In der Konvektionsgruppe war nur ein kleiner Teil der Zellen in der oberflächlichen Knorpelzone lebendig, während der Knorpel in der Nanoerwärmungsgruppe mehr lebende Zellen sowohl in der oberflächlichen als auch in der tiefen Zone aufwies (Abb. 2b). Eine quantitative Analyse der Zelllebensfähigkeit in der Oberflächenzone zeigte, dass nanoerwärmter Knorpel eine deutlich höhere Zelllebensfähigkeit aufwies als konvektionserwärmter Knorpel (Abb. 2c). Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) zeigte auch, dass der Knorpel in der Konvektionsgruppe mehr Leerraum aufwies als der Knorpel in der Frisch- und der Nanoerwärmungsgruppe (Abb. 2d). Es wird angenommen, dass diese weißen, leeren Räume ein Zeichen der Eisbildung während der Konservierung sind22, was darauf hindeutet, dass die Wiedererwärmung des Knorpels durch Konvektion fehlgeschlagen ist. Es wurde auch eine Safranin-O-Färbung durchgeführt, die im konvektionserwärmten Knorpel mehr Leerraum zeigte als im frischen und nanoerwärmten Knorpel (ergänzende Abbildung 4). Bei den drei Gruppen wurden jedoch ähnliche Farberscheinungen gefunden (ergänzende Abbildung 4), was auf minimale oder überhaupt keine Änderungen des Glykosaminoglykangehalts nach Konvektionserwärmung und Nanoerwärmung hinweist.

a Die Ergebnisse der Zellstoffwechselaktivität wurden mit dem AlamarBlue-Assay gemessen. Die Ergebnisse wurden auf den Wert des frischen Kontrollknorpels normalisiert, der am Tag 0 jedes Chargenversuchs gemessen wurde. Die graue gestrichelte Linie zeigt eine 100-prozentige Erholung an und erreicht das Niveau der Zellstoffwechselaktivität von frischem Knorpel (n = 3 unabhängige Proben für Konvektions- und Nanoerwärmungsgruppen mit VS70-Lösungen. n = 4 unabhängige Proben für Konvektions- und Nanoerwärmungsgruppen mit VS83-Lösungen) . b Repräsentative Fluoreszenz-Lebend-/Tot-Färbungsergebnisse, gemessen mit Proben, die unmittelbar nach dem Wiedererwärmen entnommen wurden. SZ oberflächliche Zone, DZ tiefe Zone. Die weiße gestrichelte Linie zeigt den oberflächlichen Bereich für die in (c) gezeigte Quantifizierungsanalyse der Zelllebensfähigkeit an. Maßstabsbalken repräsentieren 200 μm. c Zelllebensfähigkeit quantifiziert an der Oberflächenschicht von Fluoreszenz-Lebend-/Totfärbungsbildern in frischem (n = 8 unabhängige Proben), Konvektionsknorpel (n = 7 unabhängige Proben) und Nanoerwärmungsknorpel (n = 12 unabhängige Proben). Der p-Wert wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test bestimmt. d Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Färbebilder (H&E) von frischen, konvektions- und nanoerwärmenden Knorpeln wurden unmittelbar nach der Wiedererwärmung aufgenommen. SZ-Oberflächenzone, vergrößertes Bild im rot gestrichelten Kasten; DZ-Tiefzone, vergrößertes Bild im schwarzen gestrichelten Kasten. Maßstabsbalken repräsentieren 200 μm. Die schwarzen Pfeile markieren Orte mit weißem Raum, was auf eine mögliche Eisbildung hinweist. Alle Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung. Hinweis: mIONPs in der Nanowaming-Gruppe werden für alle hier dargestellten Daten durch den Immersionsansatz geladen.

Gelenkknorpel besteht hauptsächlich aus Wasser, Kollagen und Proteoglykanen und weist elektromechanische Eigenschaften auf. Veränderungen der Gewebematerialeigenschaften können daher die Knorpelfunktion negativ beeinflussen. Derzeit ist die Lebensfähigkeit der Chondrozyten der wichtigste Parameter zur Bewertung des Ergebnisses verschiedener Strategien zur Kryokonservierung von Gelenkknorpel; Die Eigenschaften der Gewebematrix werden weitgehend übersehen. In dieser Studie wurden elektrische Leitfähigkeitsmessungen mit in isotonischen und hypotonischen KCl-Lösungen äquilibriertem Knorpel verwendet, um Änderungen der Knorpelleitfähigkeit und der festen Ladungsdichte (FCD) nach Konvektionserwärmungs- und Nanoerwärmungsprozessen zu bewerten (Abb. 3a)43,44. FCD ist ein Maß für die negativen Ladungen, die an den Proteoglykanen angebracht sind43,44. Die Ergebnisse zeigten, dass die Knorpelleitfähigkeiten in der Frisch-, Konvektions- und Nanoerwärmungsgruppe sowohl unter isotonischen als auch unter hypotonischen Bedingungen ähnlich waren (Abb. 3b). Obwohl zwischen den drei Gruppen keine signifikanten Unterschiede im FCD-Gehalt festgestellt wurden, hatte die Konvektionsgruppe einen niedrigeren FCD-Wert als die Frisch- und Nanoerwärmungsgruppe (Abb. 3c). Auch die Gewebeporosität war in den drei Gruppen ähnlich (Abb. 3d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass weder Konvektion noch Nanoerwärmung größere Auswirkungen auf die elektrischen und kompositorischen Eigenschaften des Knorpels hatten, nanoerwärmter Knorpel jedoch frischem Knorpel ähnlicher war als konvektionserwärmter Knorpel.

a Schematische Darstellung der elektrischen Leitfähigkeitsmessung. Die elektrische Leitfähigkeit und FCD des Knorpels wurden mit einem maßgeschneiderten Leitfähigkeitsgerät bestimmt, das aus einem Strommessmikrometer zur Messung der Knorpeldicke, zwei Stromelektroden, zwei Ag/AgCl-Spannungselektroden und einer zylindrischen Kammer bestand. b Elektrische Leitfähigkeit von frischem (n = 11 unabhängige Proben), Konvektions- (n = 10 unabhängige Proben) und nanoerwärmendem (n = 13 unabhängige Proben) Knorpel, gemessen unter isotonischen und hypotonischen Bedingungen. c FCD von frischem (n = 11 unabhängige Proben), Konvektions- (n = 10 unabhängige Proben) und nanoerwärmendem (n = 13 unabhängige Proben) Knorpel. d Porosität von frischem (n = 11 unabhängige Proben), Konvektions- (n = 10 unabhängige Proben) und nanoerwärmendem (n = 13 unabhängige Proben) Knorpel. Alle Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung. Hinweis: mIONPs in der Nanowaming-Gruppe werden für alle hier dargestellten Daten durch den Immersionsansatz geladen.

Die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels wurden bewertet, um den Einfluss beider Erwärmungsstrategien auf die mechanische Funktion des Gewebes zu bewerten. Für alle drei Gruppen wurden Mikroindentationstests an intakten osteochondralen Plugs durchgeführt, die aus den großen OCAs gestanzt wurden (Abb. 4a). Die Einrückungsergebnisse zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (Abb. 4b, c). Allerdings war der Knorpelgleichgewichtskontaktmodul, ein Parameter, der die mechanische Festigkeit der Knorpelmatrix charakterisiert, in der Konvektionsgruppe kleiner als in der Frisch- und Nanoerwärmungsgruppe (Abb. 4b). Auch die Permeabilität war in der Konvektionsgruppe höher als in den beiden anderen Gruppen (Abb. 4c). Diese Ergebnisse deuten darüber hinaus auf eine bessere Leistung auf Gewebeebene bei der Nanoerwärmungsmethode im Vergleich zur Konvektionsmethode hin. Da der Mikroindentationstest hauptsächlich die mechanische Reaktion des Knorpels an der Oberflächenschicht (~ 200 μm) untersucht, wurde ein begrenztes Kompressionsexperiment durchgeführt, um die mechanischen Eigenschaften des Knorpels in voller Dicke zu untersuchen (Abb. 4d). Die Knochenseite der osteochondralen Pfropfen wurde abgeschnitten und für die Entspannungstests wurden zylindrische Gelenkknorpelproben in die begrenzte Kammer gegeben. Begrenzte Kompressionsexperimente zeigten, dass Knorpel sowohl aus der Konvektions- als auch aus der Nanoerwärmungsgruppe deutlich niedrigere Aggregatmodule aufwies als die Gruppe mit frischem Knorpel, während keine signifikanten Unterschiede in der Permeabilität festgestellt wurden (Abb. 4e, f). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Knorpeloberflächenschicht besser erhalten war als die mittleren oder tiefen Regionen, was die Ergebnisse der Fluoreszenz-Lebend-/Totfärbung widerspiegelt (Abb. 2b, c) und eine Tiefenabhängigkeit für die Knorpelkonservierung zeigt.

a Schematische Darstellung von Mikroindentationsexperimenten. Die mechanischen Eigenschaften der Knorpeloberfläche wurden mithilfe eines Mikroindentationssystems gemessen, das aus einem piezoelektrischen Tisch, einer 2-Achsen-Nivellierkugel, einer Probenkammer und einem kugelförmigen Rubinkugel-Eindringkörper (1 mm Durchmesser) bestand. Osteochondrale Plugs wurden getestet, während sie in PBS-Lösungen eingetaucht waren. b Ergebnisse des Gleichgewichtskontaktmoduls von frischem (n = 14 Messungen aus 5 unabhängigen Proben), Konvektions- (n = 14 Messungen aus 5 unabhängigen Proben) und nanoerwärmendem (n = 15 Messungen aus 5 unabhängigen Proben) Knorpelgewebe, ermittelt durch Mikroindentationstests. c Permeabilitätsergebnisse von frischem (n = 14 Messungen aus 5 unabhängigen Proben), Konvektions- (n = 14 Messungen aus 5 unabhängigen Proben) und nanoerwärmendem (n = 15 Messungen aus 5 unabhängigen Proben) Knorpelgewebe, ermittelt durch Mikroindentationstests. d Schema eines begrenzten Kompressionstests. Dynamisch-mechanischer DMA-Analysator. Knorpelpfropfen wurden zwischen einer Testsonde (5 mm Durchmesser) und einer porösen Platte zusammengedrückt, während sie in einem Begrenzungsring saßen. e Ergebnisse des Aggregatmoduls von frischem (n = 9 unabhängige Proben), Konvektions- (n = 7 unabhängige Proben) und nanoerwärmendem (n = 14 unabhängige Proben) Knorpel, gemessen durch begrenzte Kompressionstests. Der p-Wert wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test bestimmt. f Permeabilitätsergebnisse von frischem (n = 9 unabhängige Proben), Konvektions- (n = 7 unabhängige Proben) und nanoerwärmendem (n = 14 unabhängige Proben) Knorpel, gemessen durch begrenzte Kompressionstests. Alle Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung. Hinweis: mIONPs in der Nanowaming-Gruppe werden für alle hier dargestellten Daten durch den Immersionsansatz geladen.

Untersuchungen auf Zell- und Gewebeebene zeigen eine verbesserte Erhaltung des großen Gelenkknorpels durch Nanoerwärmung im Vergleich zur Konvektionserwärmung, insbesondere in der oberflächlichen Schicht. Um die Kapazität zur Erhaltung der Nanoerwärmung weiter zu untersuchen, wurde eine Computermodellierung verwendet, um den Nanoerwärmungsprozess des Knorpels zu simulieren. Da es in der Literatur nur sehr begrenzte thermische VS83-Daten gibt, haben wir das thermische Verhalten zwischen den VS83-Lösungen und den VS55-Lösungen verglichen. Direkte Messungen der Lösungsdichte ergaben, dass sowohl VS83 als auch VS55 ähnliche Lösungsdichten von etwa 1100 kg m-3 aufweisen (ergänzende Abbildung 5a). Unter identischen Bedingungen zeigten Temperaturmessungen durch Kühlung, Konvektionserwärmung und Nanoerwärmung alle sehr ähnliche Temperaturprofile zwischen VS55 und VS83 (ergänzende Abbildung 5b – f), was darauf hinweist, dass die thermischen Eigenschaften von VS55 und VS83 gleich sind. Daher wurden in der späteren Modellierungsstudie die thermischen Parameter von VS55-Lösungen verwendet. Als wichtiger Modelleingang wurde auch die durch Nanoerwärmung induzierte Wärmeerzeugungsrate bestimmt. Modellierungsergebnisse mit mIONPs enthaltendem VS83 zeigten eine lineare Beziehung zwischen der Heizrate und der Wärmeerzeugungsrate (\(q\)), was die gleichmäßige Erwärmungseigenschaft des Nanoerwärmungsverfahrens unterstützt (ergänzende Abbildung 5g, h). Unter Verwendung der Heizrate von 76,80 °C min-1, gemessen in VS83 mit 2 mg ml-1 mIONPs, erhielten wir den entsprechenden Wert der Wärmeerzeugungsrate, 2,956 × 106 W m-3 (ergänzende Abbildung 5h). Um den oben ermittelten Wert der Wärmeerzeugungsrate weiter zu validieren, wurde die Erwärmungsrate von VS83 mit 1 mg ml−1 mIONPs während der Nanoerwärmung gemessen und mit dem Modellwert verglichen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die experimentelle Heizrate mit 1 mg ml-1 mIONPs 41,39 ± 1,21 °C min-1 betrug, was dem Modellwert von 38,40 °C min-1 (7,8 % relativer Fehler) entsprach (ergänzende Abbildung 5h). Daher wurde der Wert der Wärmeerzeugungsrate für den VS83 mit 2 mg m−1 mIONPs auf 2,956 × 106 W m−3 geschätzt und in den nachfolgenden Modellen verwendet. Anschließend wurde die mIONP-Verteilung durch visuelle Inspektion und Magnetresonanztomographie (MRT) von OCAs untersucht. Es wurde festgestellt, dass sich das Erscheinungsbild des OCA und sein MRT-Kontrast mit zunehmender OCA-Inkubationszeit in mIONP-Lösungen nicht änderten (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 6), was darauf hindeutet, dass mIONPs nicht in der Lage waren, sowohl den Knorpel- als auch den Knochenanteil des zu durchdringen OCAs mit dem aktuellen Immersion-Loading-Protokoll. Daher wurde im Rechenmodell, bestehend aus einer OCA- und CPA-Lösung in einem zylindrischen Rohr (Abb. 5c), im OCA-Bereich keine Wärmequelle definiert.

a Visuelle Inspektion von OCA, inkubiert in VS83-Lösungen mit 2 mg ml−1 mIONPs für 0 Minuten (keine Inkubation), 3 Minuten, über Nacht (~12 Stunden) und 2 Tage (~48 Stunden). SV-Seitenansicht, BV-Knochenseitenansicht. b MRT-Scans von OCA, inkubiert in VS83-Lösungen mit 2 mg ml−1 mIONPs für 0 Minuten (keine Inkubation), 3 Minuten, über Nacht (~12 Stunden) und 2 Tage (~48 Stunden) unter Verwendung einer Gradientenechosequenz. Maßstabsbalken repräsentieren 4 mm. c Geometrie der OCA-Probe und des Rohrs für die rechnerische Modellierung der Nanoerwärmung. Das Röhrchen wurde mit den CPA-Lösungen gefüllt. Die Röhrchenabmessungen: 14 mm im Radius und 63 mm in der Höhe (~39 ml); die OCA-Abmessungen: 20 mm Breite, 30 mm Länge und 14 mm Tiefe (~9 ml). d Temperaturprofil an der Querschnittsebene des Modellsystems nach 83 s Nanoerwärmung. \(q\)Knorpel und \(q\)Knochen sind die Wärmeerzeugungsraten im Knorpelbereich bzw. im Knochenbereich. Die Stellen auf der Knorpeloberfläche (CS), 300 µm unter der Knorpeloberfläche (CS@300 µm) und an der Knorpel-Knochen-Grenzfläche (CBI) sind mit grauen, roten und gelben Punkten gekennzeichnet. e Temperaturprofil an der Querschnittsebene des Modellsystems nach 83 s Konvektionserwärmung. f Temperaturprofil auf CS, CS@300 µm und CBI für Nanoerwärmung und Konvektionserwärmung. Die grüne Linie und das hellgrün schattierte Band zeigen den durchschnittlichen Temperaturwert, der aus den experimentellen Messungen an der Knorpeloberfläche ermittelt wurde, bzw. seine Standardabweichung (n = 4 unabhängige Proben). Die grauen, roten und gelben Linien sind die Modellierungsdaten. g Heizrate auf CS, CS@300 µm und CBI, abgeleitet aus dem in (e) dargestellten Temperaturprofil. Experimentelle Daten werden aus n = 4 unabhängigen Proben gemessen. Der p-Wert wurde mit einem zweiseitigen t-Test bestimmt. Alle Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung. Hinweis: mIONPs in der Nanowaming-Gruppe werden für alle hier dargestellten Daten durch den Immersionsansatz geladen.

Die Modellierungsergebnisse zeigten eine ungleichmäßige Temperaturverteilung innerhalb der OCA (Abb. 5d), was zu erwarten war, da im OCA keine mIONPs vorhanden waren. Zum Vergleich wurde auch der Konvektionserwärmungsprozess modelliert. Die Ergebnisse zeigten einen viel langsameren Anstieg der OCA-Temperatur durch Konvektionserwärmung (Abb. 5e). Durch die Charakterisierung des Temperaturprofils in verschiedenen Knorpeltiefen wurde bei der Nanoerwärmungsmodellierung ein tiefenabhängiges Temperaturprofil beobachtet, und der Temperaturanstieg war bei der Nanoerwärmung viel schneller als bei der Konvektionserwärmung (Abb. 5d – f). Die Erwärmungsrate war an der Knorpeloberfläche am höchsten und nahm mit der Tiefe allmählich ab (Abb. 5g). Zur Validierung der Modellierungsergebnisse wurden auch experimentelle Temperaturdaten an der Knorpeloberfläche gesammelt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nanoerwärmungsgruppe einen viel schnelleren Temperaturanstieg und eine deutlich höhere Erwärmungsrate aufwies als die Konvektionserwärmungsgruppe (Abb. 5f, g). Die Modellierungsergebnisse stimmten mit den experimentellen Beobachtungen überein (Abb. 2b, c und Abb. 4), was den Nutzen der Nanoerwärmung für die Erhaltung der Knorpeloberflächenschicht zeigte und die begrenzte Kapazität der Nanoerwärmung für die Erhaltung des Knorpels in voller Dicke aufzeigte.

Die Protokolloptimierung könnte die Leistung unserer Methode zur Erhaltung großer OCAs weiter verbessern. Aufgrund des Fehlens von mIONPs in den OCAs erwärmte unsere Methode die umgebende CPA-Lösung durch Nanoerwärmung und der Knorpel wurde durch Wärmeübertragung von der umgebenden Lösung auf die Knorpeloberfläche und dann auf den tiefen Bereich des Knorpels erwärmt. Wenn die mIONPs jedoch in die Knochenregion von OCAs gelangen können, wird in der Knochenregion Wärme erzeugt. Die Wärme kann dann über den Wärmepfad an der Knochenseite des Knorpels auf den Knorpel übertragen werden, was zu einer schnelleren Wiedererwärmung des Knorpels führt. Um die Machbarkeit dieser Idee zu testen, wurde eine direkte mIONP-Injektion auf die Knochenseite durchgeführt (Abb. 6a). Die visuelle Untersuchung zeigte die erfolgreiche Abgabe von mIONPs in die OCA-Knochenregion (Abb. 6b), und die MRT-Ergebnisse bestätigten das Vorhandensein von mIONPs in der Injektionsregion (Abb. 6c). Anschließend führten wir eine Computermodellierung durch, um die Auswirkung der mIONP-Abgabe auf die OCA-Nanoerwärmung zu bewerten. Wir haben das gleiche Rechenmodell wie zuvor implementiert (Abb. 5c) und einen Wärmequellenterm im Knochenbereich eingeführt. Der Wert des Wärmequellenterms im Knochenbereich wurde in den beiden hier gezeigten Fällen entweder als die Hälfte (Abb. 6d – f) oder gleich (Abb. 6g – i) des Wertes der umgebenden CPA-Lösung definiert. Diese beiden Konzentrationen wurden ausgewählt, um zu zeigen, dass die Erwärmungsrate im tiefen Bereich des Knorpels mit zunehmenden Nanopartikelkonzentrationen auf der Knochenseite zunimmt, und sind daher als Leitfaden für die Optimierung zukünftiger Protokolle geeignet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Wärmeübertragung innerhalb der Knorpelregion effizienter ist und dass die Erwärmungsrate mit steigendem Wärmeerzeugungsniveau in der OCA-Knochenregion zunimmt (Abb. 6d–i). Daher könnte die Verbesserung der Verteilung von mIONPs in den OCA-Knochenregionen ein praktikables Mittel sein, um die Methode der Nanoerwärmung und eisfreien Kryokonservierung für die Konservierung großer OCA weiter zu verbessern.

a Schematische Darstellung der mIONP-Abgabe in die Knochenregion von OCA durch Injektion. b Visuelle Inspektion von OCA-Proben mit und ohne mIONP-Injektion. Der weiße Pfeil markiert den Injektionsbereich mit einer bräunlichen Farbe. BV-Knochenseitenansicht, CV-Querschnittsansicht. c MRT-Scans von OCA mit und ohne mIONP-Injektion mittels Gradientenechosequenz. Der weiße Pfeil markiert die Injektionsregion mit verminderten MRT-Signalen aufgrund der Anwesenheit von mIONPs. Maßstabsbalken repräsentieren 4 mm. d Temperaturprofil an der Querschnittsebene des Modellsystems nach 83 s Nanoerwärmung, wenn die Wärmeerzeugungsrate im Knochenbereich halb so groß ist wie im CPA, der die OCA umgibt. \(q\)Knorpel und \(q\)Knochen sind die Wärmeerzeugungsraten im Knorpelbereich bzw. im Knochenbereich. Die Stellen auf der Knorpeloberfläche (CS), 300 µm unter der Knorpeloberfläche (CS@300 µm) und an der Knorpel-Knochen-Grenzfläche (CBI) sind mit grauen, roten und gelben Punkten gekennzeichnet. e Temperaturprofil auf CS, CS@300 µm und CBI, dargestellt in (d). f Heizrate auf CS, CS@300 µm und CBI, abgeleitet aus dem in (e) dargestellten Temperaturprofil. Zum Vergleich wurden auch Ergebnisse der Erwärmungsrate aus der Nanoerwärmungsmodellierung ohne mIONP-Injektion in die Knochenregion vorgestellt. \(q\)bone und \(q\) sind die Wärmeerzeugungsrate im Knochenbereich bzw. in der CPA-Lösung. g Wärmeprofil an der Querschnittsebene des Modellsystems nach 83 s Nanoerwärmung, wenn die Wärmeerzeugungsrate im Knochenbereich der im CPA um den OCA entspricht. h Temperaturprofil an der Stelle von CS, CS@300 µm und CBI, dargestellt in (g). i Heizrate an der Stelle von CS, CS@300 µm und CBI, abgeleitet aus dem in (h) dargestellten Temperaturprofil. Zum Vergleich wurden auch Ergebnisse der Erwärmungsrate aus der Nanoerwärmungsmodellierung ohne mIONP-Injektion in die Knochenregion vorgestellt. \(q\)bone und \(q\) sind die Wärmeerzeugungsrate im Knochenbereich bzw. in der CPA-Lösung. Hinweis: mIONPs in der Nanowaming-Gruppe werden für alle hier dargestellten Daten durch den Injektionsansatz geladen.

Diese Studie initiiert die Kryokonservierung großer OCAs. Durch die Einbeziehung von Vitrifikation und Nanoerwärmung ermöglicht unsere Methode eine schnellere Wiedererwärmung der Probe im Vergleich zur Konvektionserwärmung, wodurch das Risiko einer Probenverletzung aufgrund von Eisbildung verringert wird. Die quantitative Analyse der Stoffwechselaktivität und Lebensfähigkeit der Knorpel-Chondrozyten-Zellen ergab, dass unsere Methode die traditionelle Konvektionsstrategie bei der Konservierung großer OCAs übertrifft. Charakterisierungen auf Gewebeebene zeigten auch, dass unsere Methode keinen negativen Einfluss auf das Knorpelmaterial und die mechanischen Eigenschaften hatte. Diese Ergebnisse belegen die Machbarkeit dieser nanoerwärmenden und eisfreien Kryokonservierungsmethode für die Kryokonservierung großer OCAs.

Die langfristige Kryokonservierung von OCA ist von entscheidender Bedeutung, um die OCA-Auslastung des Spenders zu verbessern und den OCA-Mangel zu lindern. Aktuelle Studien zum Knorpelerhalt konzentrieren sich hauptsächlich auf den Vitrifikationsprozess. Es wurden verschiedene Vitrifikationsprotokolle mit verschiedenen CPA-Lösungen, Beladungszeiten und -schritten sowie Beladungstemperaturen vorgeschlagen24,25,26,45,46. Der Erwärmungsvorgang wurde jedoch nicht ausreichend untersucht. Der Einsatz eines Warmwasserbades ist derzeit der Standard zur Probenerwärmung. Bei der Kryokonservierung kleiner OCA ist der Erwärmungsprozess weniger entscheidend für den Erfolg der Knorpelkonservierung, da die Konvektionserwärmung für eine schnelle Wiedererwärmung ausreicht. Bei größeren Proben wird die Wiedererwärmung jedoch aufgrund von Einschränkungen bei der Wärmeübertragung schwieriger. Es wurde berichtet, dass die Heizrate sinkt, wenn die Probengröße (Gewebe plus umgebende Lösungen) einen Durchmesser von 10 mm überschreitet28. Ohne neue Protokolle oder Strategien ist es unmöglich, die Anforderungen an die Heizrate für die Wiedererwärmung großer, verglaster Proben unter Verwendung der herkömmlichen Konvektionserwärmungsmethode zu erfüllen. Unsere Methode umfasst Nanoerwärmung und Vitrifizierung und bietet damit ein praktikables Mittel zur Lösung der Erwärmungsprobleme. Unsere Daten zeigten, dass die traditionelle Konvektionsmethode für die Konservierung großer OCAs nicht geeignet ist, und zeigten, dass eine Verbesserung der Heizrate erforderlich ist, um eine Kryokonservierung großer Knorpel zu erreichen. Unsere Ergebnisse stimmen mit einem aktuellen Literaturbericht überein47. In dieser früheren Literaturstudie wurden die den Kondylus umgebenden CPA-Lösungen aufgebraucht, was aufgrund des direkten Kontakts zwischen Knorpel und Wasserbad eine schnellere Wärmeübertragung ermöglicht47. Im Gegensatz dazu blieben bei unserer Nanoerwärmungsmethode die umgebenden CPAs erhalten und wurden durch Nanoerwärmung schnell erwärmt, um eine schnelle Wärmeübertragung und eine erhöhte Heizrate zu erreichen. Im Vergleich zur CPA-Abreicherungsmethode in der Literatur besteht bei der Nanoerwärmung eine geringere Wahrscheinlichkeit, einen signifikanten Wärmegradienten über die Proben hinweg zu erzeugen, da die Probenoberfläche nicht sofort auf eine hohe Temperatur erhitzt wird und die Heizeffizienz durch die Abgabe von Nanopartikeln an den Knochenbereich flexibel verbessert werden kann wie hier gezeigt (Abb. 6). Darüber hinaus könnte die Beibehaltung der umgebenden CPA-Lösung dazu beitragen, den OCA zu isolieren, wodurch verhindert wird, dass OCAs direkten Kontakt mit anderen Oberflächen haben, und möglicherweise Schäden während der Lagerung oder des Transports vermieden werden. Eine umfassende Bewertung auf Zell- und Gewebeebene hat die Vorteile unserer Methode gegenüber der Konvektionsmethode gezeigt. Es besteht ein großer klinischer Bedarf an einer großen OCA-Kryokonservierung, um die chirurgische Planung zu unterstützen, indem zusätzliche Zeit für den Spender-Empfänger-Abgleich und das Screening zur Verfügung steht. Darüber hinaus bieten große, konservierte OCAs im Vergleich zu kleinen OCAs die Flexibilität, Transplantate jeder Größe und Form zu entnehmen, um sie zum Zeitpunkt der Operation an die Defektstelle des Patienten anzupassen.

Nanowarming ist eine vielversprechende Technik zur Erhaltung großer Gewebe- und Organe. In dieser Studie haben wir die Anwendung der Nanoerwärmung zur Konservierung von Schweine-OCAs mit einem Gewebevolumen von etwa 9 ml (ein Gesamtvolumen von ~39 ml einschließlich der umgebenden 30 ml CPA) demonstriert, was viel größer ist als zuvor verwendete Gewebe und Organe in der Literatur berichtet30,31,32,38. Nanoerwärmung wurde angewendet, um Schweinearterien, Schweineherzklappen, Rattenherzen und Rattennieren zu erhalten; Rattenherzen und -nieren haben relativ kleine Volumina, ≤ 1 ml, während die Arterien und Herzklappen von Schweinen beide dünn sind. Unbestreitbar haben diese Literaturberichte das Konzept der Nanoerwärmung erfolgreich eingeführt und die Fähigkeit der Nanoerwärmung zur Konservierung biologischer Proben, insbesondere komplexer Organe wie Herz und Niere, nachgewiesen. Die Scale-up-Funktion der Nanoerwärmung zur Erhaltung großer Gewebe- und Organe wurde jedoch noch nicht nachgewiesen. Hier haben wir die Nanoerwärmung mit einem großen Stück biologischen Gewebes implementiert und die Ergebnisse der Nanoerwärmung für die Erhaltung großer Gewebe systematisch bewertet und so die Nanoerwärmungstechnik in die klinische Praxis überführt. Darüber hinaus ist der Gelenkknorpel ein dichtes Gewebe und verfügt über kein Blutgefäßnetz. Im Gegensatz zu vaskularisierten Systemen wie Herz und Niere können mIONPs durch Eintauchen oder Perfusion nicht gleichmäßig im Gewebe verteilt werden; Eine visuelle Untersuchung und MRT-Scans zeigten, dass im Gewebe keine mIONPs vorhanden waren (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 6). Obwohl eine gleichmäßige Erwärmung aufgrund des Fehlens von mIONPs im Knorpel nicht erreicht werden konnte, kann die den Knorpel umgebende Lösung schnell erwärmt werden und die Wärme auf den Knorpel übertragen. Die resultierende Erwärmungsrate im Gewebe erreichte 16,0–38,5 °C min−1, was viel höher ist als die 6,2–17,6 °C min−1, die durch Konvektionserwärmung erreicht werden. Die Erwärmungsrate der Nanoerwärmung muss hoch genug sein, um eine Schädigung des Knorpelgewebes während des Wiedererwärmungsprozesses zu vermeiden. Diese Annahme wurde sowohl durch In-vitro-Experimente als auch durch Modellierungsergebnisse gestützt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Nanoerwärmung dazu beiträgt, den Knorpel großer OCAs, insbesondere an der Oberflächenschicht, besser zu erhalten, und dass die Nanoerwärmung ein praktikabler Ansatz für die Erhaltung dichter und avaskulärer Gewebe ist.

Die Testergebnisse von AlarmarBlue zeigten, dass eine Erhöhung der CPA-Konzentration die Stoffwechselaktivitäten der Chondrozyten bei beiden Erwärmungsmethoden dramatisch steigerte. Eine höhere CPA-Konzentration verringert in der Regel kritische Abkühlungs-/Erwärmungsraten und verringert somit die Wahrscheinlichkeit der Eisbildung sowohl während des Abkühlungs- als auch des Erwärmungsprozesses. Dies könnte den beobachteten Vorteil der in dieser Studie verwendeten CPA mit hoher Konzentration (VS83) für die OCA-Konservierung gegenüber der CPA mit niedrigerer Konzentration (VS55 und VS70) erklären (Abb. 2a und ergänzende Abb. 3). Die Ergebnisse der Zellstoffwechselaktivität zeigten eine bessere Wiederherstellung der Zellfunktion in der Nanoerwärmungsgruppe als in der Konvektionsgruppe (normalisierte Zellstoffwechselaktivität bei Gewebekultur am Tag 3: Nanoerwärmung vs. Konvektion in der VS83-Gruppe, 102 ± 14 % bzw. 63 ± 12 %). Unsere Ergebnisse der Lebend-/Totfärbung zeigten auch, dass die Nanoerwärmung mehr lebende Zellen rettete als die Konvektionserwärmung (Lebensfähigkeit der Zellen: Nanoerwärmung vs. Konvektion, 46,1 ± 15,9 % bzw. 26,4 ± 9,8 %). Allerdings unterschied sich die Lebensfähigkeit der Zellen von nanoerwärmtem Knorpel von der von frischem Knorpel. Die Ergebnisse der Lebend-/Tot-Färbung zeigten, dass nanoerwärmter Knorpel in der oberflächlichen Knorpelschicht eine sehr starke grüne Fluoreszenz aufwies, in der mittleren und tiefen Zone des Knorpels jedoch schwache grüne Signale, während frischer Knorpel in allen Tiefen homogene grüne Signale aufwies. Zellen in den mittleren und tiefen Zonen des nanoerwärmten Knorpels waren nicht so aktiv wie die Zellen in frischem Knorpel (dh mit weniger Enzymen, die mit Calcein AM interagieren und ein grünes Fluoreszenzsignal erzeugen konnten). Die unterschiedlichen Ergebnisse der Lebend-/Totfärbung bei unterschiedlichen Knorpeltiefen könnten mit der tiefenabhängigen Erwärmungsrate korrelieren. Die Knorpelschicht mit einer höheren Erwärmungsrate enthielt mehr lebende und funktionsfähige Chondrozyten. Die Analyse der Zelllebensfähigkeit basierte auf Messungen unmittelbar nach dem Wiedererwärmen. Zukünftige Studien sollten die Lebensfähigkeit der Zellen nach einer Knorpelgewebekultur untersuchen, um die Unterschiede zwischen nanoerwärmtem und frischem Knorpel besser vergleichen zu können.

Gelenkknorpel ist eine komplexe Mischung aus Wasser und extrazellulären Matrixbestandteilen. Da Knorpelleitfähigkeit und FCD wichtige Knorpelmaterialeigenschaften sind, die das elektromechanische Verhalten regulieren, ist eine quantitative Analyse erforderlich, um die Wirksamkeit der Kryokonservierung zu bewerten. Die in dieser Studie ermittelte Leitfähigkeit von frischem Knorpel stimmt gut mit der von anderen Gruppen gemessenen überein18,48. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die Leitfähigkeit des Knorpels nach 28-tägiger unterkühlter Lagerung abnimmt18. Unsere Ergebnisse zeigten keine signifikanten Veränderungen der Knorpelleitfähigkeit nach der Kryokonservierung mit Konvektions- und Nanoerwärmungsmethoden, was darauf hindeutet, dass unsere Methode nur einen sehr begrenzten Einfluss auf das elektrische Verhalten des Knorpels hat. Darüber hinaus beobachteten wir im nanoerwärmten Knorpel einen mit dem frischen Knorpel vergleichbaren FCD, im konvektionserwärmten Knorpel jedoch einen verringerten FCD. Dieses Ergebnis legt nahe, dass der durch Konvektion erwärmte Knorpel möglicherweise seinen Glykosaminoglykangehalt verliert und zum Matrixabbau neigt49 und daher nicht für die Implantation geeignet ist.

Nur wenige Studien haben den Einfluss der Kryokonservierung auf die mechanischen Eigenschaften des Knorpels untersucht. Durch die Durchführung sowohl lokaler als auch mechanischer Tests über die gesamte Dicke deuteten unsere Ergebnisse auf tiefenabhängige Veränderungen der mechanischen Eigenschaften des Knorpels nach der Kryokonservierung hin. An der Knorpeloberfläche weist nanoerwärmter Knorpel vergleichbare mechanische Eigenschaften wie frischer Knorpel auf. Die Probengröße betrug in unserer Studie ~30 mm × 20 mm × 14 mm (Länge × Breite × Dicke) und war damit viel größer als in früheren Literaturberichten. Kiefer et al. verwendeten kleinen Rindergelenkknorpel (6 mm Durchmesser, 3 mm Dicke), um die Auswirkung der Kryokonservierung auf das mechanische Verhalten zu untersuchen, und fanden keine signifikanten Veränderungen nach der Kryokonservierung50. Li et al. zeigten auch, dass vitrifizierter Schweineknorpel (9 mm Durchmesser) vergleichbare mechanische Eigenschaften wie frischer Knorpel aufwies51. Unsere Ergebnisse mit großen Proben stimmten mit diesen früheren Literaturergebnissen mit kleinen Proben überein50,51, was auf die skalierbare Kapazität unserer Methode zur Kryokonservierung von Knorpel hinweist. Nanoerwärmter Knorpel zeigte jedoch beeinträchtigte mechanische Eigenschaften in voller Dicke, was auf die Notwendigkeit einer weiteren Optimierung des Nanoerwärmungsprotokolls hindeutet. Wie die Modellierungsarbeiten zeigen, könnte die Abgabe von mIONPs an die Knochenregion von OCAs eine mögliche Lösung sein. Zukünftige Studien können die Leistung dieser Strategie experimentell bewerten und verwandte Methoden zum Auswaschen der mIONPs untersuchen.

Unsere Nanoerwärmungsmodellierungsergebnisse an der Knorpeloberfläche zeigten einige Unterschiede zu den experimentellen Messungen zu späteren Zeitpunkten (Abb. 5f). Die Diskrepanzen zwischen den experimentellen und den Modellergebnissen könnten durch die Verwendung temperaturunabhängiger thermischer CPA-Eigenschaften in unserem Modell verursacht werden. Es hat sich gezeigt, dass die thermischen CPA-Parameter wie spezifische Wärme, Wärmeleitfähigkeit und Dichte temperaturabhängig sind28,31,32,52,53,54. Es wurde auch berichtet, dass die Wärmeerzeugungsrate der Nanoerwärmung temperaturabhängig ist31,32,52. Alle diese Parameter könnten die Modellvorhersagen beeinflussen und müssen daher experimentell bestimmt werden. In unserer Studie wurde ein vereinfachtes Modell erstellt und die gemittelten thermischen CPA-Eigenschaften, wie sie in einem früheren Bericht30,55 verwendet wurden, angewendet. Mithilfe dieses vereinfachten Modells können wir mögliche Ursachen für unsere experimentellen tiefenabhängigen Konservierungsbeobachtungen aufdecken und mögliche Mittel zur weiteren Verbesserung des OCA-Konservierungsergebnisses aufzeigen. Zukünftige Studien sind sicherlich erforderlich, um ein umfassenderes Modell zu erstellen, das die tatsächliche Nanoerwärmung anhand der OCA-Probe darstellt. Angesichts der begrenzten Datenlage zu den thermischen Eigenschaften von VS83 wird es auch von entscheidender Bedeutung sein, eine Datenbank mit verschiedenen thermischen Eigenschaften von CPA im Bereich der Kryokonservierung einzurichten.

In dieser Studie haben wir uns hauptsächlich auf den Erwärmungsprozess konzentriert. Allerdings beeinflussen mehrere Faktoren die Ergebnisse der Kryokonservierung, darunter verschiedene Einstellungen für die Kühl- und Erwärmungsschritte. Zukünftige Studien können die neuesten Fortschritte bei der Kryokonservierung einbeziehen, um die CPA-Beladung zu erhöhen und die CPA-Toxizität zu reduzieren, um die Ergebnisse der Kryokonservierung weiter zu verbessern. Beispielsweise kann die Zugabe von Zusatzstoffen zu den CPA-Lösungen die Ergebnisse weiter verbessern, da Zusatzstoffe wie Chondroitinsulfat und Ascorbinsäure nachweislich die Toxizität hoher Kryoschutzmittelkonzentrationen abschwächen26. Darüber hinaus kann das Nanoerwärmungsprotokoll mit Hilfe von Computermodellen und fortschrittlichen Herstellungstechniken weiter optimiert werden, um stabilere, biokompatiblere und effizientere wärmeerzeugende Nanopartikel herzustellen31,39,45.

Mit einer weiteren Optimierung des Nanoerwärmungsprotokolls wird diese Biobanking-Methode zur Knorpelkonservierung die Nutzung des begrenzten Angebots an Allotransplantaten erheblich verbessern, das langfristige Überleben von Allotransplantaten in vivo erhöhen und die klinischen Anwendungen der osteochondralen Allotransplantattransplantation erweitern.

Frische Oberschenkeltrochlea von geschlechtsreifen (geschlechtsgemischten) Yorkshire-Hausschweinen (4–6 Monate alt) wurden von einem örtlichen Schlachthof bezogen und etwa 4 Stunden nach dem Tod für das Konservierungsverfahren verwendet. Die Verwendung tierischer Gewebe ist von der Clemson University und der Medical University of South Carolina genehmigt. Für diese Studie wurden keine Tiere gezielt getötet. Osteochondrale Allotransplantate (OCAs) der femoralen Trochlea (Länge × Breite × Dicke, ~ 30 mm × 20 mm × 14 mm), die ~ 25 % der Trochlea ausmachen, wurden geerntet (Abb. 1a) und in sterile Becher mit kaltem Dulbecco gegeben modifiziertes Eagle-Medium (DMEM; Corning, Arizona), ergänzt mit 100 IE pro ml Penicillin und 100 μg ml-1 Streptomycin (Millipore Sigma, MO). Anschließend wurden sie nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt: frisch, Vitrifizierung mit Konvektionserwärmung und Vitrifizierung mit Nanoerwärmung.

In dieser Studie wurden drei verschiedene Vitrifikationslösungen getestet: das häufig verwendete VS55 (3,10 M DMSO, 3,10 M Formamid und 2,21 M 1,2-Propandiol), unser kürzlich entwickeltes VS83 (4,65 M DMSO, 4,65 M Formamid und 3,31 M 1). 2-Propandiol)25 und VS70 (3,97 M DMSO, 3,97 M Formamid und 2,83 M 1,2-Propandiol), eine CPA-Lösung mit einer Konzentration zwischen VS55 und VS83. OCAs wurden nach und nach mit VS83, VS70 oder VS55 in EuroCollins-Lösung bei 4 °C infiltriert. Die vorgekühlten verdünnten Vitrifikationslösungen wurden in sechs aufeinanderfolgenden 20-minütigen Schritten mit zunehmender Konzentration (0 %, 18,5 %, 25 %, 50 %, 75 % und 100 %) auf Eis gegeben (Abb. 1b). Jede Probe wurde dann in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, das 30 ml vorgekühlte 100 %ige Vitrifikationslösungen (4 °C) mit oder ohne 2 mg Fe pro ml (Ferrotec, EMG-308) für Nanoerwärmungs- bzw. Konvektionsgruppen enthielt. Anschließend wurden alle Proben sofort in ein vorgekühltes 2-Methylbutan-Bad bei –135 °C gegeben und verglast25. Die Proben wurden vor dem Wiedererwärmen mindestens eine Woche lang bei –135 °C in einem mechanischen Gefrierschrank gelagert. Das hier beschriebene mIONP-Beladungsprotokoll in der Nanowarming-Gruppe wurde als Immersionsbeladungsmethode definiert, da die CPA-beladenen OCAs mit mIONPs in die CPA übertragen und dann sofort vitrifiziert wurden.

Verglaste OCAs in der Konvektionserwärmungsgruppe wurden erwärmt, indem der Kunststoffbehälter mit den Proben in ein Wasserbad bei 37 °C gestellt wurde. Nach dem Wiedererwärmen wurde die Vitrifikationslösung in sieben aufeinanderfolgenden 20-minütigen Schritten bei 0 °C in das DMEM-Kulturmedium entfernt.

Verglaste OCAs in der Nanoerwärmungsgruppe wurden in ca. 80 s mit einem 5,0-kW-Terminal, 230 kHz, dem Festkörper-Induktionsnetzteil EASYHEAT 5060LI mit einem ferngesteuerten Arbeitskopf und einer maßgeschneiderten Spiralspule mit mehreren Windungen und 6–7 Windungen erwärmt, um eine 35 zu erzeugen kA m−1 Magnetfeld im Zentrum. Nach dem Wiedererwärmen wurden die mIONPs und die Vitrifikationslösung auf ähnliche Weise abgewaschen, wie für die Proben in der Konvektionserwärmungsgruppe beschrieben.

Die Temperatur-Zeit-Kurven sowohl bei Abkühl- als auch bei Erwärmungsprozessen wurden mit einem faseroptischen Signalaufbereiter (FOTEMP1-H, Micronor INC, Camarillo, CA) gemessen, der mit einem faseroptischen Temperatursensor (TS3, Micronor INC, Camarillo, CA) gekoppelt war. Für die Temperaturmessung in den CPA-Lösungen (sowohl VS55 als auch VS83) wurde der faseroptische Temperatursensor entlang der Achse des 50-ml-Falcon-Röhrchens gut befestigt (ergänzende Abbildung 2a). Die Sensorspitze wurde in der Mitte der gefüllten CPA-Lösungen positioniert, um das Temperaturprofil in der Mitte der CPA-Lösung zu bestimmen (ergänzende Abbildung 2a). Für die Temperaturmessung an der Knorpeloberfläche von OCAs, die in den VS83 mit/ohne mIONPs (zur Konvektionserwärmung bzw. Nanoerwärmung) eingetaucht waren, war die Sensorspitze gut in der Mitte der Knorpeloberfläche positioniert. Die Abkühltemperaturkurve wurde gemessen, während die Proben (reine CPA-Lösungen oder OCA in VS83) nach dem Abkühlvorgang vitrifiziert wurden. Die Abkühlgeschwindigkeit wurde als erste Ableitung der Temperatur-Zeit-Kurve zu jedem Zeitpunkt berechnet. Für die Erwärmungstemperaturkurve wurde der Temperaturanstieg während des Prozesses der Konvektionserwärmung und der Nanoerwärmung aufgezeichnet. Die Heizrate wurde als mittlere Heizrate (dh der Betrag des Temperaturanstiegs dividiert durch die Zeit) der ersten 10–60 s der Temperaturdaten bestimmt.

Nach dem Wiedererwärmungsprozess wurden OCAs für den Zellstoffwechselaktivitätstest gesammelt. Zuerst wurde die Knochenseite des OCA entfernt. Die verbleibenden Gelenkknorpelproben wurden dann in kleine Stücke geschnitten und eine Stunde lang in 2 ml DMEM inkubiert, um sich auszugleichen, gefolgt von der Zugabe von 10 % AlamarBlue (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) unter Standard-Zellkulturbedingungen für 3 Stunden. Die Fluoreszenzmenge jedes Knorpelstücks wurde in 12–24 Duplikaten mit dem Multimode-Mikroplattenlesegerät bei einer Anregungswellenlänge von 544 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm gemessen. Da alamarBlue nicht zytotoxisch ist, wurden Knorpelproben aus den Konvektions- und Nanoerwärmungsgruppen drei Tage lang in dem Medium kultiviert und täglich wurden die gleichen Fluoreszenzmessungen durchgeführt, um die Charakterisierung von Veränderungen der Zellaktivität im Laufe der Zeit zu ermöglichen. Nachdem die endgültige Fluoreszenz abgelesen wurde, wurden die Knorpelproben getrocknet und gewogen. Der durchschnittliche Fluoreszenzwert der Blindproben (nur AlamarBlue-Lösung ohne Knorpelproben) wurde vom Fluoreszenzwert jedes Knorpelstücks abgezogen und dann durch das Knorpeltrockengewicht dividiert, um relative Fluoreszenzeinheiten pro mg Trockengewebe zu erhalten. Die Ergebnisse der Konvektions- und Nanoerwärmungsgruppen wurden auf die Ergebnisse normalisiert, die an frischem Knorpel am Tag 0 gemessen wurden, um Prozentsätze zu erhalten.

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels Fluoreszenz-Lebend-/Totfärbung untersucht. Knorpelstreifen voller Dicke wurden manuell mit einer Rasierklinge aus den Knorpelproben herausgeschnitten und in DMEM-Kulturmedium mit 2 µM Calcein AM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) und 4 µM Ethidium Homodimer-1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham) eingetaucht , MA) bei Raumtemperatur für 1 Stunde vor der Bildgebung. Calcein AM ist zellmembrandurchlässig und interagiert mit den zytoplasmatischen Esterasen in lebenden Zellen, um ein grünes Fluoreszenzsignal zu erzeugen. Ethidium homodimer-1 hingegen ist membranundurchlässig, dringt in tote Zellen mit beschädigten Zellmembranen ein und bindet sich an Kernsäure, um ein rotes Fluoreszenzsignal zu erzeugen. Anschließend wurden die gefärbten Knorpelstreifen auf eine Petrischale mit Glasboden gelegt, wobei die Querschnittsseite über dem Glas lag. Für die Bildgebung wurde ein invertiertes Olympus FV1200MPE Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop (Olympus, Center Valley, PA) mit einem ×10-Objektiv verwendet. Die Anregungswellenlänge betrug 800 nm56. Das grüne Fluoreszenzsignal wurde im Bereich von 495–540 nm erfasst, während das rote Fluoreszenzsignal im Bereich von 575–630 nm erfasst wurde. Querschnittsbilder wurden in einer Tiefe von 100 µm unter der Gewebeoberfläche aufgenommen. Nach der Fluoreszenzbildgebung wurde die Lebensfähigkeit der Zellen in der Knorpeloberflächenschicht (innerhalb von ~400 µm von der Knorpeloberfläche entfernt) mit ImageJ (V1.52a, National Institutes of Health, Bethesda, MD) quantifiziert. Die Intensität der Fluoreszenzsignale des grünen und roten Kanals wird zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen genutzt. Zellen mit höherer grüner Fluoreszenzintensität wurden als lebende Zellen gezählt, während Zellen mit höherer roter Fluoreszenzintensität als tote Zellen gezählt wurden. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als das Verhältnis zwischen der Anzahl lebender Zellen und der Gesamtzahl der Zellen (Anzahl lebender Zellen plus Anzahl toter Zellen) definiert.

Osteochondrale Pfropfen, die aus den drei Versuchsgruppen (frisch, Konvektion und Nanoerwärmung) gesammelt wurden, wurden in 10 %iger Formalinlösung fixiert, dehydriert und dann in Paraffin eingebettet. 5-µm-Schnitte wurden mit einem Mikrotom geschnitten und für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und die Safranin-O-Färbung verarbeitet. Hellfeldbilder wurden mit ×4- und ×10-Objektiven auf einem Olympus BX40-Mikroskop (Olympus, Center Valley, PA) aufgenommen.

Ein maßgeschneidertes Leitfähigkeitsgerät (Abb. 3a) wurde verwendet, um die elektrische Leitfähigkeit des Gewebes zu untersuchen und die feste Ladungsdichte des Knorpels (FCD) zu bestimmen43,44,57. Die Leitfähigkeitskammer besteht aus Stromquellen- und Spannungsmesselektroden, die um eine Plexiglaskammer herum angeordnet sind, in der sich jede Probe befindet. Unter Verwendung eines Keithley Source Meter (Modell 2400, Keithley Instruments, Inc., Cleveland, OH) wurde der Widerstand (R) über die Probe bei einer sehr niedrigen Stromdichte von 0,015 mA cm-2 bestimmt. Die entsprechende elektrische Leitfähigkeit (\(\chi\)) wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

wobei \(h\) und \({A}\) die Höhe bzw. die Querschnittsfläche der Probe sind. Die Probendicke \(h\) wurde mit einem Strommessmikrometer unmittelbar vor der Leitfähigkeitsmessung gemessen. Der FCD wurde durch eine Zweipunktmethode der elektrischen Leitfähigkeit bestimmt. Knorpelproben wurden mit einem Trepan in zylindrische 5-mm-Pfropfen gestanzt und auf beiden Seiten mit einem Mikrotom beschnitten, um sicherzustellen, dass die Oberfläche flach war. Die Proben wurden dann 12 Stunden lang bei 4 °C in isotonische KCl-Lösung (0,15 M) eingetaucht, während sie axial zwischen zwei hydrophilen porösen Polyethylenplatten (50–90 µm; Small Parts, Inc., Miami Lakes, FL) mit einem Durchmesser von 5 mm eingeschlossen waren Kammer. Nach der Inkubation wurde die elektrische Leitfähigkeit des Knorpels gemessen (\({\chi }_{{{\rm {Iso}}}}\)). Unmittelbar nach der Messung in einer isotonischen Lösung wurden die Proben 12 Stunden lang in hypotonischer KCl-Lösung (0,03 M) inkubiert und die Knorpelleitfähigkeit (\({\chi }_{{{\rm {Hypo}}}}\)) erneut gemessen . Der Proben-FCD (\({c}^{{\rm {F}}}\)) wurde dann durch die beiden Leitfähigkeiten bestimmt, die unter isotonischen und hypotonischen Bedingungen gemessen wurden43,44:

wobei \({c}_{{{\rm {Iso}}}}^{* }\) und \({c}_{{{\rm {Hypo}}}}^{* }\) die sind Ionenkonzentrationen der isotonischen bzw. hypotonischen KCl-Lösungen. Alle elektrischen Leitfähigkeitsmessungen wurden bei Raumtemperatur (22 °C) durchgeführt.

Die Porosität der Knorpelproben wurde mithilfe der Auftriebsmethode gemessen. Unmittelbar vor der Inkubation der Probe in einer isotonischen Lösung wurde das Gewicht der Probe in Luft (\({W}_{{{\rm {wet}}}}\)) und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (\({W}_{ {{\rm {PBS}}}}\)) mit einem Dichtebestimmungskit und einer Analysenwaage (Sartorius YDK01, Deutschland). Unmittelbar nach der Leitfähigkeitsmessung im hypotonen Zustand wurden die Proben lyophilisiert und das Trockengewicht (\({W}_{{{\rm {dry}}}}\)) aufgezeichnet. Die Porosität (\({\phi }^{{\rm {W}}}\)) wurde bestimmt durch:

wobei \({\rho }_{{{\rm {PBS}}}}\) und \({\rho }_{{\rm {w}}}\) die Dichte der PBS-Lösung und des Wassers sind, jeweils.

Mikroindentationstests wurden mit einem Bioindentersystem (UNHT3 Bio, Anton Paar, Schweiz) durchgeführt (Abb. 4a). Die Auflösung für Kraft und Weg betrug jeweils 0,001 µN und 0,006 nm. In der Mitte jeder einzelnen Probe wurde ein osteochondraler Stopfen mit 5 mm Durchmesser ausgestanzt. Mit einem kalibrierten Stereoskop wurden vier Dickenmessungen in gleichen Abständen durchgeführt und der Durchschnittswert als Knorpeldicke definiert. Nach der Dickenmessung wurden osteochondrale Stopfen senkrecht auf dem Probenhalter montiert, wobei das Knochenende sorgfältig mit einer kleinen Menge Cyanacrylat auf eine Petrischale geklebt wurde. Dann wurde PBS-Lösung hinzugefügt, um die Probe vollständig einzutauchen. Der Probenhalter war gut positioniert, um sicherzustellen, dass der Eindringkörper senkrecht zur Knorpeloberfläche stand. Zur Prüfung wurde ein kugelförmiger Rubinkugel-Eindringkörper (1 mm Durchmesser) verwendet. Zu Beginn des Kriechtests wurde eine Taralast von 0,05 mN angelegt und 600 s lang gehalten, gefolgt von einer Stufenlast von 5 mN für 800 s, um die Kriechdaten zu generieren. Die Eindruckkraft- und Verschiebungsdaten wurden bei 20 Hz erfasst. Im zentralen Bereich jeder Probe wurden zwei bis drei Eindrucktests im Abstand von ca. 500 µm durchgeführt. Die Kriechdaten wurden mit der Hertzschen biophysikalischen Theorie analysiert, um den Gleichgewichtskontaktmodul und die hydraulische Permeabilität an der Knorpeloberfläche zu ermitteln58.

Mit einem dynamischen mechanischen Analysegerät (DMA Q800, TA Instruments, Delaware, USA) wurden begrenzte mechanische Kompressionstests mit den Knorpelproben durchgeführt (Abb. 4d). Die Präzision der Kraft- und Wegmessungen betrug 0,1 mN bzw. 0,1 µm. Knorpelproben für die mechanischen Tests wurden zunächst mit einem Trepan in einen 5-mm-Zylinderpfropfen gestanzt und mit einem Mikrotom flach zugeschnitten. Dann wurden 5-mm-Knorpelproben zwischen einer Testsonde (5 mm Durchmesser) oben und einer starren, porösen, durchlässigen Platte (~20 µm) unten axial komprimiert. Die Proben wurden zunächst mit einer Taralast (0,05 N) zusammengedrückt, um den Kontakt zwischen Probe und Prüfsonde sicherzustellen und die anfängliche Probenhöhe zu messen. Dann wurde vorsichtig PBS in die Kammer gegeben und eine Druckspannung von 10 % (relativ zur Anfangshöhe) angelegt. Man ließ die Proben ein Gleichgewicht erreichen (~1 Stunde) und die Gleichgewichtsspannung wurde aufgezeichnet. Unter Verwendung der Zweiphasentheorie59 wurden der Gleichgewichts-Druckaggregatmodul und der hydraulische Permeabilitätskoeffizient durch Anpassen der Spannungsrelaxationskurve bestimmt.

Frische OCAs wurden zunächst 2 Stunden lang in VS83-Lösungen ohne mIONPs eingetaucht und dann vor MRT-Scans unterschiedlich lange (3 Minuten, über Nacht und 2 Tage) in VS83-Lösungen mit 2 mg ml−1 mIONPs inkubiert. Als Kontrollgruppe wurden OCAs verwendet, die in VS83-Lösungen ohne mIONPs getaucht waren. Vor der MRT-Untersuchung wurden die überschüssigen CPA-Lösungen rund um die OCAs entfernt und die OCAs mit Plastikfolie umwickelt. Anschließend wurde ein 7-T-MRT-Scanner (BioSpec 70/30 USR, Bruker Corp., Ettlingen, Deutschland) verwendet, um die OCA-Proben sowohl mit der Gradientenechosequenz als auch mit der Spinechosequenz zu scannen. 1 % Agarosegele mit unterschiedlichen mIONP-Konzentrationen wurden als Standardphantome hergestellt, um den MRT-Kontrast mit der Anwesenheit von mIONPs zu zeigen, und wurden mit den identischen Sequenzen gescannt, die für die OCA-Bildgebung verwendet wurden. Die Scaneinstellungen für die Gradientenechosequenz waren: Wiederholungszeit/Echozeit (TR/TE) = 200/2,5 ms, Flipwinkel = 30°, Sichtfeld = 40 mm × 30 mm, Matrixgröße = 256 × 192 Zoll -Ebenenauflösung = 0,156 mm × 0,156 mm; Schichtdicke = 1,0 mm mit 0,3 mm Spalt, Gesamtscanzeit = 1,5 Min. Das Scanprotokoll für die Spin-Echo-Sequenz lautete: TR/TE = 2000/5 ms, Flipwinkel = 90°, Sichtfeld = 40 mm × 30 mm, Matrixgröße = 128 × 128, Auflösung in der Ebene = 0,313 mm × 0,234 mm; Schichtdicke = 1,0 mm mit 0,3 mm Spalt, Gesamtscanzeit = 4,5 Min.

Der Nanoerwärmungsprozess wurde mit der Finite-Elemente-Analysesoftware COMSOL (V5.4, COMSOL Inc, Burlington, MA) simuliert. Es wurden zwei Rechenmodelle erstellt, um die Nanoerwärmung nur mit den VS83-Lösungen und die Nanoerwärmung mit OCA-Proben in den VS83-Lösungen zu simulieren. Das Modell für die Nanoerwärmung der VS83-Lösung wurde als zylindrisches Rohr (14 mm × 49 mm, Radius × Höhe) vereinfacht, das mit CPA-Lösung mit mIONPs gefüllt war, entsprechend 30 ml der im eigentlichen Experiment verwendeten CPA-Lösung (ergänzende Abbildung 5g). . Das Rechenmodell für die OCA-Proben bestand aus einem zylindrischen Rohr (14 mm × 63 mm, Radius × Höhe) und dem osteochondralen Block (30 mm × 20 mm × 14 mm, Länge × Breite × Dicke) (Abb. 5c). Die Knorpeldicke wurde mit 2 mm45 definiert. Das thermische Profil wurde durch die Wärmeübertragungsgleichung bestimmt:

Dabei ist \(\rho\) die Dichte, \({C}_{{\rm {p}}}\) die spezifische Wärme, \(k\) die Wärmeleitfähigkeit und \(t\). Zeit, \(T\) ist die Temperatur und \(q\) ist die Wärmeerzeugungsrate aufgrund der Nanoerwärmung. Gemäß früherer Literatur31,32 wurden in diesem Modell CPA-Lösungseigenschaften anstelle des CPA-durchdrungenen osteochondralen Transplantats verwendet. In der Literatur gibt es nur sehr begrenzte thermische VS83-Daten. Da unsere Ergebnisse zeigten, dass VS83 ähnliche thermische Eigenschaften wie VS55 aufweist (ergänzende Abbildung 5a–f), sind die thermischen Parameter der VS55-Lösung (\(\rho\) = 1100 kg m−3, \({C}_{{\ rm {p}}}\) = 2,1 × 103 J kg−1 K−1, \(k\) = 0,3 W m−1 K−1)30,55 wurden in dieser Studie angewendet. Der Wärmeerzeugungsterm \(q\) im OCA wurde aufgrund des Fehlens der Nanopartikel als Null definiert (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 6). Die Wärmeerzeugungsrate in der umgebenden CPA-Lösung wurde durch Nanoerwärmungsexperimente mit CPA-Lösungen mit mIONPs bestimmt und validiert. Als Randbedingung für das Rohr wurde Isolierung angenommen28. Für die Simulation von zwei Fällen von Nanoerwärmung mit Nanopartikeln, die in den Knochenbereich des OCA abgegeben wurden, wurde die Wärmeerzeugungsrate im Knochenbereich entweder auf die Hälfte (Abb. 6d – f) oder gleich (Abb. 6g – i) eingestellt der umgebenden CPA-Lösung. Die übrigen Parameter wurden wie in der vorherigen Simulation beibehalten. Auch die Konvektionserwärmung wurde modelliert. Obwohl der Wärmeübertragungskoeffizient zwischen Rohr und Warmwasserbad in dieser Studie nicht bestimmt wurde, haben wir eine konstante Rohroberflächentemperatur von 37 °C (d. h. unendlicher Wärmeübertragungskoeffizient) eingestellt, um die höchste Heizrate der Konvektionserwärmung zu modellieren. Alle Modelle verwenden in COMSOL besonders feine Netzeinstellungen.

Ein zweiseitiger t-Test wurde durchgeführt, um den Unterschied in der Heizrate zwischen Konvektionserwärmung und Nanoerwärmung zu bewerten. Eine einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test wurde verwendet, um Unterschiede in der auf Fluoreszenzbildgebung basierenden Lebensfähigkeit der Zellen, der elektrischen Leitfähigkeit, dem FCD, der Porosität und den mechanischen Eigenschaften von Knorpelproben zwischen den Frisch-, Konvektions- und Nanoerwärmungsgruppen zu untersuchen. Da im Mikroindentationstest mehrere Messungen an verschiedenen Stellen derselben Probe durchgeführt wurden, wurde der Messort als Kovariate für die statistische Analyse definiert. Alle Analysen wurden in SPSS (IBM SPSS Statistics, Version 24.0, IBM Corp., Armonk, NY) durchgeführt. Signifikante Unterschiede wurden bei p < 0,05 gemeldet, wobei die deskriptive Statistik als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben wurde.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Rohdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Die Quelldaten für die Zahlen finden Sie in den Zusatzdaten in diesem Dokument.

Giwa, S. et al. Das Versprechen der Organ- und Gewebekonservierung wird die Medizin verändern. Nat. Biotechnologie. 35, 530–542 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rana, A. et al. Überlebensvorteil einer Organtransplantation in den Vereinigten Staaten. JAMA Surg. 150, 252–259 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Netzwerk für Organbeschaffung und Transplantation https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data (2020).

Lewis, JK et al. Die großen Herausforderungen des Organbankings: Tagungsband des ersten globalen Gipfels zur komplexen Kryokonservierung von Gewebe. Kryobiologie 72, 169–182 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Widuchowski, W., Widuchowski, J. & Trzaska, T. Gelenkknorpeldefekte: Untersuchung von 25.124 Kniearthroskopien. Knie 14, 177–182 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Arøen, A. et al. Gelenkknorpelläsionen bei 993 aufeinanderfolgenden Kniearthroskopien. Bin. J. Sports Med. 32, 211–215 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Hjelle, K., Solheim, E., Strand, T., Muri, R. & Brittberg, M. Gelenkknorpeldefekte bei 1.000 Kniearthroskopien. Arthroskopie 18, 730–734 (2002).

Artikel PubMed Google Scholar

Curl, WW et al. Knorpelverletzungen: eine Übersicht über 31.516 Kniearthroskopien. Arthroskopie 13, 456–460 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhao, X. et al. Klinische, humanistische und wirtschaftliche Belastung durch Arthrose bei nicht institutionalisierten Erwachsenen in den Vereinigten Staaten. Osteoarthr. Knorpel. 27, 1618–1626 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Hootman, JM, Helmick, CG, Barbour, KE, Theis, KA & Boring, MA Aktualisierte prognostizierte Prävalenz selbstberichteter ärztlich diagnostizierter Arthritis und arthritisbedingter Aktivitätseinschränkungen bei Erwachsenen in den USA, 2015–2040. Arthritis Rheumatol. 68, 1582–1587 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sherman, SL et al. Frische osteochondrale Allotransplantattransplantation für das Knie: aktuelle Konzepte. Marmelade. Acad. Orthop. Surg. 22, 121–133 (2014).

PubMed Google Scholar

Chahal, J., Rogers, BA & Gross, AE in Articular Cartilage of the Knee: Health, Disease and Therapy (Hrsg. Gahunia, HK et al.) 289–314 (Springer, New York, 2020).

Bedi, A., Feeley, BT & Williams, RJ 3. Management von Gelenkknorpeldefekten des Knies. J. Bone Jt. Surg. Bin. 92, 994–1009 (2010).

Artikel Google Scholar

Familiari, F. et al. Klinische Ergebnisse und Misserfolgsraten der osteochondralen Allotransplantattransplantation im Knie: eine systematische Übersicht. Bin. J. Sports Med. 46, 3541–3549 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Grant, JA Ergebnisse im Zusammenhang mit der Rückkehr zum Sport nach einer osteochondralen Allotransplantattransplantation im Knie: eine Scoping-Überprüfung. Curr. Rev. Muskel-Skelett. Med. 12, 181–189 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gowd, AK et al. Management chondraler Läsionen des Knies: Analyse von Trends und kurzfristigen Komplikationen mithilfe der National Surgical Quality Improvement Program Database. Arthroskopie 35, 138–146 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Williams, SK et al. Längere Lagerungseffekte auf den Gelenkknorpel frischer menschlicher osteochondraler Allotransplantate. J. Bone Jt. Surg. Bin. 85, 2111–2120 (2003).

Artikel Google Scholar

Brockbank, KGM, Rahn, E., Wright, GJ, Chen, Z. & Yao, H. Einfluss von Hypothermie auf die Lebensfähigkeit von Chondrozyten und die Durchlässigkeit der Knorpelmatrix nach 1 Monat gekühlter Lagerung. Transfus. Med. Hämutter. 38, 387–392 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Goodfriend, B., Essilfie, AA, Jones, IA & Thomas Vangsness, C. Frische osteochondrale Transplantation in den Vereinigten Staaten: der aktuelle Stand der Gewebebankverarbeitung. Zellgewebebank. 20, 331–337 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Pallante, AL et al. Behandlung von Gelenkknorpeldefekten bei der Ziege mit gefrorenen versus frischen osteochondralen Allotransplantaten: Auswirkungen auf die Knorpelsteifheit, die zonale Zusammensetzung und die Struktur nach sechs Monaten. J. Bone Jt. Surg. Bin. 94, 1984–1995 (2012).

Artikel Google Scholar

Enneking, WF & Campanacci, DA Entnommene menschliche Allotransplantate: eine klinisch-pathologische Studie. J. Bone Jt. Surg. Bin. 83, 971–986 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Song, YC, Lightfoot, FG, Chen, Z., Taylor, MJ & Brockbank, KGM Glaskörperkonservierung des Gelenkknorpels von Kaninchen. Zellkonservierung. Technol. 2, 67–74 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Song, YC et al. Glaskörperkonservierung von Gelenkknorpeltransplantaten. J. Investig. Surg. 17, 65–70 (2004).

Artikel Google Scholar

Wu, K. et al. Vergleich von drei Beladungsprotokollen mit mehreren Kryoschutzmitteln zur Vitrifizierung von Gelenkknorpel von Schweinen. Kryobiologie 92, 151–160 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Brockbank, KGM, Chen, ZZ & Song, YC Vitrifizierung von Schweinegelenkknorpel. Cryobiology 60, 217–221 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Crisol, M. et al. Wirksamkeit von Chondroitinsulfat und Ascorbinsäure in klinischer Qualität bei der Abschwächung der kryoprotektiven Toxizität im Gelenkknorpel von Schweinen. Biokonserv. Biobank. 20, 401–408 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Jomha, NM et al. Vitrifizierung von intaktem menschlichem Gelenkknorpel. Biomaterialien 33, 6061–6068 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Etheridge, ML et al. Die HF-Erwärmung magnetischer Nanopartikel verbessert das Auftauen kryokonservierter Biomaterialien. Technologie 02, 229–242 (2014).

Artikel Google Scholar

Peyridieu, JF et al. Kritische Kühl- und Erwärmungsraten zur Vermeidung von Eiskristallisierung in kleinen Teilen von Säugetierorganen, die mit Kryoschutzmitteln durchdrungen sind. Cryobiology 33, 436–446 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Manuchehrabadi, N. et al. Verbesserte Kryokonservierung von Gewebe durch induktive Erwärmung magnetischer Nanopartikel. Wissenschaft. Übers. Med. 9, eaah4586 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gao, Z. et al. Vitrifizierung und Wiedererwärmung von mit magnetischen Nanopartikeln beladenen Rattenherzen. Adv. Mater. Technol. 7, 2100873 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Sharma, A. et al. Vitrifizierung und Nanoerwärmung der Nieren. Adv. Wissenschaft. (Weinh.) 8, e2101691 (2021).

PubMed Google Scholar

Khosla, K. et al. Charakterisierung der Laser-Gold-Nanoerwärmung: eine Plattform für die Kryokonservierung im Millimeterbereich. Langmuir 35, 7364–7375 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jin, B., Kleinhans, FW & Mazur, P. Die Überlebensrate von Maus-Eizellen nähert sich 100 % nach Vitrifizierung in dreifach verdünntem Medium und ultraschneller Erwärmung durch einen IR-Laserpuls. Kryobiologie 68, 419–430 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pan, J. et al. Auf dem Weg zu einer gleichmäßigen und schnellen Wiedererwärmung für die Kryokonservierung mit einem elektromagnetischen Resonanzhohlraum: numerische Simulation und experimentelle Untersuchung. Appl. Therm. Ing. 140, 787–798 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Burdette, EC & Karow, AM Jr. Nierenmodell zur Untersuchung des elektromagnetischen Auftauens. Cryobiology 15, 142–151 (1978).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Robinson, MP, Wusteman, MC, Wang, L. & Pegg, DE Elektromagnetische Wiedererwärmung kryokonservierter Gewebe: Auswirkung der Wahl des Kryoschutzmittels und der Probenform auf die Gleichmäßigkeit der Erwärmung. Physik. Med. Biol. 47, 2311–2325 (2002).

Artikel PubMed Google Scholar

Chiu-Lam, A., Staples, E., Pepine, CJ & Rinaldi, C. Perfusion, Kryokonservierung und Nanoerwärmung ganzer Herzen unter Verwendung kolloidal stabiler magnetischer Kryokonservierungslösungen. Wissenschaft. Adv. 7, eabe3005 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ito, A. et al. Magnetische Erwärmung von Nanopartikeln als skalierbare Kryokonservierungstechnologie für vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen. Wissenschaft. Rep. 10, 13605 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, X., Zhao, G., Chen, Z., Panhwar, F. & He, ACS Appl Mater. Schnittstellen 10, 16822–16835 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, J., Zhao, G., Zhang, Z., Xu, X. & He, Acta Biomater. 33, 264–274 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo, D., Yu, C., He, L., Lu, C. & Gao, D. Entwicklung eines elektromagnetischen Einzelmode-Resonanzhohlraums zur Wiedererwärmung kryokonservierter Biomaterialien. Kryobiologie 53, 288–293 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wright, GJ et al. Elektrische Leitfähigkeitsmethode zur Bestimmung sexueller Dimorphismen in der festen Ladungsdichte der menschlichen Kiefergelenksscheibe. Ann. Biomed. Ing. 46, 310–317 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Jackson, AR, Yuan, T.-Y., Huang, C.-Y. & Gu, WY Ein Leitfähigkeitsansatz zur Messung der festen Ladungsdichte im Bandscheibengewebe. Ann. Biomed. Ing. 37, 2566–2573 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Shardt, N. et al. Verwendung technischer Modelle zur Verkürzung der Ladezeit mit Kryoschutzmitteln für die Vitrifizierung von Gelenkknorpel. Kryobiologie 92, 180–188 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shardt, N. et al. Kryoprotektive kinetische Analyse eines Vitrifizierungsprotokolls für menschlichen Gelenkknorpel. Cryobiology 73, 80–92 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, K., Laouar, L., Elliott, JAW & Jomha, NM Vitrifizierung intakter femoraler Kondylustransplantate vom Schwein unter Verwendung eines optimierten Ansatzes. Knorpel 13, 1688S–1699S (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hasegawa, I., Kuriki, S., Matsuno, S. & Matsumoto, G. Abhängigkeit der elektrischen Leitfähigkeit von der festen Ladungsdichte im Gelenkknorpel. Klin. Orthop. Relat. Res. 177, 283–288 (1983).

Saarakkala, S. et al. Tiefenprogression der Arthrose im menschlichen Gelenkknorpel: Untersuchung der Zusammensetzung, Struktur und Biomechanik. Osteoarthr. Knorpel. 18, 73–81 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Kiefer, GN et al. Die Auswirkung der Kryokonservierung auf das biomechanische Verhalten von Rindergelenkknorpel. J. Orthop. Res. 7, 494–501 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, X. et al. Mikroindentationstest zur Beurteilung der mechanischen Eigenschaften von Knorpelgeweben. J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomaterial. 80, 25–31 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Joshi, P., Ehrlich, LE, Gao, Z., Bischof, JC & Rabin, Y. Thermische Analysen der durch Nanoerwärmung unterstützten Wiederherstellung des Herzens nach der Kryokonservierung durch Vitrifikation. J. Wärmeübertragung. 144, 031202 (2022).

Artikel Google Scholar

Phatak, S., Natesan, H., Choi, J., Brockbank, KGM & Bischof, JC Messung der spezifischen Wärme und Kristallisation in Kryoschutzsystemen VS55, DP6 und M22 mit und ohne Saccharose. Biokonserv. Biobank. 16, 270–277 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Eisenberg, DP, Bischof, JC & Rabin, Y. Thermomechanischer Stress bei der Kryokonservierung durch Vitrifikation mit Nanopartikelerwärmung als stressmoderierende Wirkung. J. Biomech. Ing. 138, https://doi.org/10.1115/1.4032053 (2016).

Ehrlich, LE, Gao, Z., Bischof, JC & Rabin, Y. Wärmeleitfähigkeit von mit Nanopartikeln beladenen Kryoschutzmitteln mit Anwendung auf die Wiederherstellung konservierter Gewebe und Organe aus der Kryolagerung. PLoS ONE 15, e0238941 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Y. et al. Nichtmarkierung und quantitative Bewertung der Lebensfähigkeit von Chondrozyten im Gelenkknorpel mit intrinsischen nichtlinearen optischen Signaturen. Exp. Biol. Med. (Maywood) 245, 348–359 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, Y. et al. Quantifizierung der festen Grundladungsdichte in der Endplatte des gesunden menschlichen Knorpels: eine Zwei-Punkt-Methode der elektrischen Leitfähigkeit. Wirbelsäule 42, E1002–E1009 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, AC, DeLucca, JF, Elliott, DM & Burris, DL Quantifizierung des Knorpelkontaktmoduls, des Spannungsmoduls und der Permeabilität mit dem Hertzschen biphasischen Kriechen. J. Tribol. 138, 0414051–0414057 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mow, VC, Kuei, SC, Lai, WM & Armstrong, CG Biphasisches Kriechen und Spannungsrelaxation des Gelenkknorpels bei Kompression? Theorie und Experimente. J. Biomech. Ing. 102, 73–84 (1980).

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Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) R44AR073136 an KGMB, P20GM121342 und R01DE021134 an HY unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch das Postdoktorandenstipendium DE017551 des NIH T32 an RGH und CH sowie das NIH-Stipendium K99DE031345 an CH unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise auch unterstützt durch die Cell & Molecular Imaging Shared Resource, Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina (P30CA138313), den SC COBRE in Oxidants, Redox Balance, and Stress Signaling (P20GM103542) und den Shared Instrumentation Grant S10OD018113.

Abteilung für Bioingenieurwesen, Clemson University, Clemson, SC, USA

Peng Chen, Shangping Wang, Pengling Ren, R. Glenn Hepfer, Cherice Hill, Yongren Wu, Kelvin GM Brockbank und Hai Yao

Tissue Testing Technology LLC, North Charleston, SC, USA

Zhenzhen Chen, Elizabeth D. Greene, Lia H. Campbell und Kelvin GM Brockbank

Abteilung für Orthopädie, Medizinische Universität von South Carolina, Charleston, SC, USA

Pengling Ren, Yongren Wu und Hai Yao

Abteilung für Mundgesundheitswissenschaften, Medizinische Universität von South Carolina, Charleston, SC, USA

R. Glenn Hepfer, Cherice Hill & Hai Yao

Abteilung für Vergleichende Medizin, Medizinische Universität von South Carolina, Charleston, SC, USA

Kristi L. Helke

Abteilung für Neurowissenschaften, Medizinische Universität von South Carolina, Charleston, SC, USA

Xingju Nie & Jens H. Jensen

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Das Manuskript wurde durch Beiträge aller Autoren verfasst. Alle Autoren haben der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt. HY, KGMB und PC hatten die Idee und konzipierten die Experimente. PC, SW, ZC, PR, RGH und YW führten die Experimente auf Zell- und Gewebeebene durch. ZC, EDG, LHC, PC und SW führten die Vitrifizierungs- und Nanoerwärmungsprozesse durch. KLH, PC und SW führten die histologische Analyse durch. PC, XN und JHJ führten die MRT-Scans durch. PC und HY analysierten die Daten. PC und HY haben das Manuskript verfasst. PC, SW, ZC, CH, KGMB und HY haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Hai Yao.

KGMB, ZC, EDG und LHC sind Mitarbeiter von Tissue Testing Technology LLC. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin: Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, P., Wang, S., Chen, Z. et al. Nanoerwärmung und eisfreie Kryokonservierung von großem, intaktem Schweinegelenkknorpel. Commun Biol 6, 220 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04577-9

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Eingegangen: 21. Juni 2022

Angenommen: 10. Februar 2023

Veröffentlicht: 24. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04577-9

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